流式細胞以檢測分析的對象是細胞或者細胞樣顆粒性物質(zhì)，所以流式細胞術(shù)是細胞學(xué)的重要研究手段之一下面我們介紹一下用于流式細胞儀分析的單細胞懸液。

獨立細胞樣品的制備

1. 如果是是懸浮細胞則直接收集細胞于離心管，離心沉淀細胞，用PBS重懸洗一次，然后固定待測，或取適量細胞與EP管中，標(biāo)記相應(yīng)的熒光偶聯(lián)抗體，zui后吸取未結(jié)合的抗體，然后固定待測。
2. 如果細胞是貼壁細胞，需要胰酶消化細胞適當(dāng)時間后，用移液器反復(fù)吹打，收集待測樣品細胞，離心后固定，或標(biāo)記抗體。
   • 將培養(yǎng)細胞用0.25%的胰蛋白酶消化，至顯微鏡下見到貼壁細胞回縮變圓為止，棄掉消化液，加入PBS用吸管將細胞從瓶壁上輕輕吹打下來，并移入離心管中。
   • 短時低速離心，即1000r/min離心5min
   • 棄上清，加pH 7.4的PBS液洗2次，1000r/min離心5min，以去除細胞懸液中的細胞碎片
   • 加入固定液固定或低溫保存待用。
3. 如果研究對象是外周血，根據(jù)目標(biāo)細胞的不同可以有兩種處理方法。如果研究對象是外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）,zui常用的提取方法是Ficoll-hypague密度梯度離心法。

Ficoll-hypague密度梯度離心法分離PBMC：

• 抽取適量的血液于離心管中，該離心管必須事先加上抗凝劑，防止血液凝固。
• 用PBS稀釋血液，稀釋倍數(shù)可以根據(jù)血液的稠度加以調(diào)整，一般以2-4倍為宜。
• 根據(jù)血液的總量選用15ml離心管或者50ml離心管，先加入離心管1/4體積的Ficoll分離液，然后慢慢將稀釋后的血液小心疊加到Ficoll分離液的上層，體積是Ficoll液體積的2.5-3倍為宜。注意疊加血液時一定要輕柔，避免加入的血液與Ficoll液相混合，這一步很關(guān)鍵，如果血液層與Ficoll液層互相混合，就無法成功分離PBMC
• 將離心管在水平離心機中離心，2000r/min離心30min。
• 取出離心管，此時離心管內(nèi)的液體分為三層，上層為血漿，中層為含PBMC的Ficoll液，zui下層為紅細胞，注意此時要輕拿輕放，切勿將分層的液體重新混勻。PBMC主要位于Ficoll液的上層，即血漿與Ficoll液層的交界處，肉眼見到的混濁絮狀物就是PBMC，用吸管小心吸取中層的Ficoll液，盡量吸盡其中的混濁絮狀物，吸入少量血漿不會影響結(jié)果，但需避免吸入zui下層的紅細胞。

將得到的含有PBMC的中層Ficoll分離液置于新的離心管中，用PBS稀釋，至少稀釋一倍。此PBS稀釋步驟*，如果不經(jīng)PBS稀釋直接離心，則離心

• 時無法有效沉淀PBMC，因為PBMC密度小于Ficoll液，不稀釋直接離心時PBMC仍將位于Ficoll分離液上層。
• 低速離心10min。使PBMC沉淀，而血小板懸浮于上層液體中，棄去含有血小板的上層液體。如果血小板去除不滿意，可以重復(fù)低速離心一次。
• 用PBS重懸PBMC沉淀，1500r/min離心10min，沉淀即為PBMC。
• 用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭ɑ蛑玫蜏乇浔４妗?/SPAN>

如果研究對象是包括多核粒細胞的外周血白細胞，就不能用Ficoll-hypague密度梯度離心法，因為該法會同時去除多核粒細胞和紅細胞。這時可以采取直接用紅細胞裂解液裂解紅細胞的方法，然后多次低速離心去除紅細胞碎片即可。

收集人的外周血方法比較簡單，直接靜脈采血，收集于抗凝管中即可。收集小鼠的外周血zui常用的方法是眼眶取血法。

如果研究對象是胸水、腹水、腦脊液等體液內(nèi)的細胞，只需直接將標(biāo)本離心，PBS重懸沉淀 ，然后細胞固定或低溫冰箱保存。

胸、腹水脫落細胞的制備：

a．抽取胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放入鹽水瓶置于4℃冰箱中靜置6-12h，棄去上清

b．將底部10-20ml用長吸管移入試管中，用PBS液洗3次，以1500r/min離心沉淀5min

c．再加入5ml PBS，用300目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清

d．加固定液或低溫保存