背景知識(shí) 

CIK是單個(gè)核細(xì)胞在CD3單抗和多種細(xì)胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培養(yǎng)獲得的一群以CD3+CD56+細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群，其既具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性，又具有NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。

CIK細(xì)胞優(yōu)勢(shì)：殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對(duì)正常組織毒性低，體外可高度擴(kuò)增，是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細(xì)胞。

【培養(yǎng)原理】

CIK培養(yǎng)用細(xì)胞因子和抗體：

1. CD3激發(fā)型單抗：

T細(xì)胞活化的*信號(hào)來自于T細(xì)胞表面的受體，即T細(xì)胞抗原受體(T cell antigen receptor, TCR)與APC提呈的抗原的特異性結(jié)合，也就是T細(xì)胞對(duì)抗原的特異性識(shí)別。TCR是由2條不同肽鏈構(gòu)成的異二聚體，在T細(xì)胞表面，其與CD3分子通過非共價(jià)鍵結(jié)合，形成 TCR/CD3復(fù)合體。TCR識(shí)別特異性抗原后會(huì)引起CD3和T細(xì)胞表面的輔助受體CD4或 CD8分子的胞漿尾部聚集，進(jìn)而激活與胞漿尾部相連的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞漿區(qū)的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)進(jìn)一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，從而引起激酶活化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)(磷脂酰肌醇途徑或 MAP激酶途徑等)，zui終通過激活轉(zhuǎn)錄因子，使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合于調(diào)控T細(xì)胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-γ等)，引起基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，T細(xì)胞因而由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)為增殖和活化狀態(tài)。

由上可見，CD3分子在T細(xì)胞活化信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其關(guān)鍵的作用。CD3激發(fā)型單抗與T細(xì)胞表面CD3分子特異性結(jié)合后，可引起CD3分子胞漿區(qū)ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致 T細(xì)胞增殖和活化的下游信號(hào)的激活，從而使T細(xì)胞增殖和活化。也就是說，CD3激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3復(fù)合物的識(shí)別和激活過程，從而引起 T細(xì)胞的增殖與活化，因此是CIK細(xì)胞培養(yǎng)中*的刺激因素。

此外，CD3激發(fā)型單抗在選用時(shí)一定要注意克隆號(hào)。研究表明，僅克隆號(hào)為OKT-3的 CD3激發(fā)型單抗可以刺激所有人的T細(xì)胞的增殖，而其它克隆號(hào)的CD3激發(fā)型單抗僅能刺激一部分人的 T細(xì)胞。因此，在進(jìn)行CIK培養(yǎng)時(shí)，選用OKT-3克隆，以保證每個(gè)患者的 T細(xì)胞均能被激活。

2. IL-2 (白細(xì)胞介素-2)

IL-2zui初發(fā)現(xiàn)時(shí)被稱為T細(xì)胞生長因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T細(xì)胞增殖zui重要的細(xì)胞因子。IL-2既是自分泌細(xì)胞因子，也是旁分泌細(xì)胞因子，其通過與T細(xì)胞表面的IL-2受體(IL-2R)的特異性結(jié)合而促使T細(xì)胞活化，并進(jìn)入細(xì)胞分裂狀態(tài)。

此外，IL-2還可刺激NK細(xì)胞的生長并增強(qiáng)其殺傷能力。因此CIK細(xì)胞培養(yǎng)中須添加IL-2，以促進(jìn)T細(xì)胞的增殖與活化。

3. IFN-γ(干擾素-γ)

IFN-γ具有上調(diào)外周血淋巴細(xì)胞表面IL-2R表達(dá)的作用，因此會(huì)增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)IL-2促增殖反應(yīng)的敏感度和強(qiáng)度。在誘導(dǎo)CIK細(xì)胞形成的過程中加入IFN-γ，可降低IL-2的用量。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ加入的順序與CIK的細(xì)胞毒活性密切相關(guān)。先加入IFN-γ，培養(yǎng)24后再加入IL-2，可明顯提高CIK的細(xì)胞毒活性。

4. IL-1α(白細(xì)胞介素-1α)

IL-1α也可以介導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)IL-2R。當(dāng)IL-1α與IFN-γ和激發(fā)型CD3單抗合用時(shí)，可以明顯提高CIK的細(xì)胞毒作用。

【細(xì)胞制備】

1．外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集

1.1 用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞50-100mL；

1.2 淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)；

1.3 無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC。

2．CIK細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

2.1 將PBMC按1-2x 106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)液中，加入1,000 U/ml的重組人IFN-γ，37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

2.2 24h后加入50ng/ml的CD3單克隆抗體和300 U/ml的重組人IL-2，刺激CIK細(xì)胞的生長和增殖；

注：此時(shí)也可同時(shí)加入100 U/ml的重組人IL-1α。

2.3每3天半量換液或擴(kuò)瓶一次，并補(bǔ)加重組人IL-2 300 U/ml；

2.4在培養(yǎng)的第14d，收獲CIK細(xì)胞。

2.5 CIK細(xì)胞質(zhì)控：

2.5.1 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；

2.5.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達(dá)：CD3+CD56+細(xì)胞的比例應(yīng)在20%以上。

2.5.3 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)：以CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以腫瘤細(xì)胞(可為原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞株)為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按10:1(數(shù)目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶細(xì)胞1 x 104個(gè)，終體積為200μl，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率。

2.5.4收獲細(xì)胞前，取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測(cè)支原體、衣原體，及內(nèi)毒素(標(biāo)準(zhǔn)：病原學(xué)檢測(cè)陰性，內(nèi)毒素<5 Eu)。

【步驟簡圖】

【推薦試劑】

注：Animal Free意為無動(dòng)物成分。無動(dòng)物成分的重組細(xì)胞因子在生產(chǎn)過程中不會(huì)有任何動(dòng)物源性物質(zhì)，尤其是牛蛋白的混入，使得zui終獲得的重組人蛋白中不含任何動(dòng)物成分。這樣可避免動(dòng)物病原體(如瘋牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的機(jī)體異種排斥和過敏反應(yīng)，因此細(xì)胞治療的體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用無動(dòng)物成分的重組細(xì)胞因子。

【背景知識(shí)】

DC是“

CIK是單個(gè)核細(xì)胞在CD3單抗和多種細(xì)胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培養(yǎng)獲得的一群以CD3+CD56+細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群，其既具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性，又具有NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。

DC-CIK (或DC+CIK)[1]是指與DC細(xì)胞共培養(yǎng)的CIK細(xì)胞，也可以說，zui終的效應(yīng)細(xì)胞是經(jīng)DC體外活化的CIK細(xì)胞。多項(xiàng)研究表明，DC與CIK具有協(xié)同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表達(dá)及抗原遞呈能力均明顯提高，而CIK的增殖能力和體內(nèi)外細(xì)胞毒活性也得以增強(qiáng)，因此DC-CIK較單獨(dú)的CIK治療更為有效。若將腫瘤抗原負(fù)載的DC與CIK共培養(yǎng)，可刺激產(chǎn)生腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞，這樣的DC-CIK治療則兼具特異性和非特異性雙重腫瘤殺傷作用，比未負(fù)載腫瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更強(qiáng)，常被用于臨床和科研。

CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞是細(xì)胞免疫治療的2個(gè)重要組成部分，兩者聯(lián)合可確保的免疫反應(yīng)。

【培養(yǎng)原理】

1．DC培養(yǎng)用細(xì)胞因子：

1.1 GM-CSF(粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子)

GM-CSF是一種造血生長因子，在體外可刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的集落形成，并具有促進(jìn)早期紅巨核細(xì)胞、嗜酸性祖細(xì)胞增殖和發(fā)育的功能。

GM-CSF是zui早被鑒定出來對(duì)于DC有作用的細(xì)胞因子之一。GM-CSF在DC培養(yǎng)中的功能是促進(jìn)單核細(xì)胞向大巨噬樣細(xì)胞分化，細(xì)胞表面MHC II類分子的表達(dá)得以提高，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗原遞呈功能。此外，GM-CSF還可促進(jìn)DC的存活。

1.2 IL-4 (白細(xì)胞介素-4)

IL-4在由單核細(xì)胞誘導(dǎo)成DC的過程中發(fā)揮的作用是抑制巨噬細(xì)胞的過度生長，從而引導(dǎo)單核細(xì)胞向DC方向分化。若培養(yǎng)體系中不加IL-4，單核細(xì)胞將分化為巨噬細(xì)胞。同時(shí)，IL-4還有降低細(xì)胞表面表達(dá)CD14分子的能力。CD14表達(dá)水平的降低是單核細(xì)胞分化為DC的重要標(biāo)志。

GM-CSF和IL-4共同作用可使單核細(xì)胞定向分化為未成熟DC(immature DC)，此時(shí)的DC具有較強(qiáng)的抗原攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細(xì)胞表面中度表達(dá)MHC I類、II類分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，但不表達(dá)CD14。

1.3 TNF-α (腫瘤壞死因子-α)

TNF-α可下調(diào)未成熟DC的巨胞飲作用和表面Fc受體的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)MHC II類分子區(qū)室(class II compartment)消失，但能夠上調(diào)細(xì)胞表面 MHC I類、II類分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表達(dá)，使未成熟DC分化為成熟DC(mature DC)，此時(shí)DC的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強(qiáng)，可*的激活T細(xì)胞。

2. CIK培養(yǎng)用細(xì)胞因子和抗體（同上）

【細(xì)胞制備】

1．外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集

1.1用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞80-100mL；

1.2淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)；

1.3無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的 PBMC，細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到1-3x108。

2．(可選步驟) 腫瘤抗原的制備

用于負(fù)載 DC的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是腫瘤全細(xì)胞抗原。

用TSA或 TAA負(fù)載的DC具有很好的靶向性，但該方法具有已確定的腫瘤特異性抗原或抗原肽種類少和單一抗原的免疫攻擊經(jīng)常無法殺傷腫瘤細(xì)胞等缺陷。而用腫瘤全細(xì)胞抗原負(fù)載DC可克服這些缺陷，因?yàn)榇藭r(shí)無需知道那些抗原是腫瘤細(xì)胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊DC可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)不同抗原決定簇的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)克隆，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷。

腫瘤細(xì)胞全抗原負(fù)載DC的方法很多，包括用腫瘤細(xì)胞裂解液負(fù)載DC、用凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載DC、用壞死或死亡的腫瘤細(xì)胞負(fù)載DC，用腫瘤活細(xì)胞負(fù)載DC，和將腫瘤細(xì)胞與DC融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細(xì)胞裂解液負(fù)載DC，因該方法簡單、快速、有效。    

反復(fù)凍融是獲得腫瘤細(xì)胞裂解液的常見方法，具體步驟如下：

2.1手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；

2.2無菌生理鹽水洗3次；

2.3用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入RPMI 1640培養(yǎng)基，充分研磨；

2.4 200目無菌網(wǎng)過濾后收集單細(xì)胞懸液；

2.5用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至1-2 x 107/ml，裝入5ml無菌凍存管中；

2.6將凍存管浸入液氮中速凍，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解凍10 min。

反復(fù) 3-5 次；

注：也可以-80℃/37℃ 反復(fù)凍融3-5次。

2.7將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm，離心10min；

2.8收取上清，0.22μm 濾膜過濾除菌，留樣檢測(cè)蛋白含量及細(xì)菌、真菌和支原體；

2.9 -80oC保存?zhèn)溆谩?/P>

3. CIK 細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

3.1 步驟1中獲得的PBMC用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2 x 106/ml，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)；

3.2 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育2h，以使單核細(xì)胞貼壁；

3.3 收集懸浮細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至 1-2 x 106/ml；

3.4 加入1,000 U/ml 的重組人IFN-γ培養(yǎng)；

3.5 24h 后加入50ng/ml的CD3單克隆抗體和300 U/ml的重組人IL-2，刺激CIK細(xì)胞的生長和增殖；

注：此時(shí)也可同時(shí)加入100 U/ml的重組人IL-1。

3.6 每3天半量換液或擴(kuò)瓶一次，并補(bǔ)加重組人IL-2 300 U/ml；

3.7 在培養(yǎng)的第7d，收獲CIK細(xì)胞，此時(shí)數(shù)量應(yīng)達(dá)到1x109個(gè)以上。

3.8 CIK細(xì)胞質(zhì)控：

3.8.1 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；

3.8.2 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD8和CD56等分子的表達(dá)，觀察CD3+CD56+細(xì)胞的比例是否明顯提高。

4．DC 細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

4.1 步驟3.2中剩下的貼壁細(xì)胞(主要是 CD14+的單核細(xì)胞)，加入含重組人GM-CSF 500-1,000U/ml和重組人IL-4 500U/ml的無血清培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向DC細(xì)胞分化；

4.2 每3d半量換液一次，并補(bǔ)足細(xì)胞因子；

4.3 (可選步驟) 在培養(yǎng)的第5d，加入步驟2中獲得的腫瘤抗原50μg/ml，對(duì)DC進(jìn)行抗原負(fù)載；

注：若不對(duì)DC進(jìn)行抗原負(fù)載，該步省略。

4.4在培養(yǎng)的第6d，加入重組人TNF-γ(500U/ml)，誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟；

4.5在培養(yǎng)的第7d或第8d，收獲DC細(xì)胞，其數(shù)量應(yīng)達(dá)到1×106個(gè)以上；

4.6 DC的質(zhì)檢：

4.6.1 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；

4.6.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞表面HLA-DR、CD83和CD86等分子的表達(dá)，以確定DC 是否成熟。

5. DC-CIK 細(xì)胞的制備和質(zhì)檢

5.1 收集步驟4和步驟3中所獲得的DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞，按1:10 (數(shù)目比)的比例共培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)液中添加重組人IL-2 (300 U/ml)；

5.2 每3天半量換液一次，并補(bǔ)加重組人IL-2 (300U/ml)；

5.3 在第7d收集細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量應(yīng)達(dá)到1×1010個(gè)以上；

5.4 DC-CIK細(xì)胞的質(zhì)檢：

5.4.1 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；

5.4.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達(dá)：CD3+CD56+細(xì)胞的比例應(yīng)在20%以上。

5.4.3 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)：以DC-CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以腫瘤細(xì)胞(可為原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞株)為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按10:1(數(shù)目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶細(xì)胞1x104個(gè)，終體積為200μl，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率。

5.4.4收獲細(xì)胞前，取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測(cè)支原體、衣原體，及內(nèi)毒素(標(biāo)準(zhǔn)：病原學(xué)檢測(cè)陰性，內(nèi)毒素<5 Eu)。

【步驟簡圖】

【推薦試劑】

注：Animal Free 意為無動(dòng)物成分。無動(dòng)物成分的重組細(xì)胞因子在生產(chǎn)過程中不會(huì)有任何動(dòng)物源性物質(zhì)，尤其是牛蛋白的混入，使得zui終獲得的重組人蛋白中不含任何動(dòng)物成分。這樣可避免動(dòng)物病原體(如瘋牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的機(jī)體異種排斥和過敏反應(yīng)，因此細(xì)胞治療的體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用無動(dòng)物成分的重組細(xì)胞因子。

【其它相關(guān)試劑】

【參考文獻(xiàn)】
[1] Steinman RM, Cohn ZA. "Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution". J. Exp. Med. 1973; 137 (5):1142–62.
[2] 張志偉，宋鑫。DC-CIK細(xì)胞臨床制備規(guī)范化研究。中國腫瘤，2011；20(2)：85-88。
[3] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133.

一、CIK 

CIK（High-efficiency cytokine-induced killer），即細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，是治療腫瘤和慢性傳染性病毒感染的細(xì)胞免疫治療方法之一。其技術(shù)是從患者自體外周血（20～100ml）中分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)過體外刺激擴(kuò)增培養(yǎng)，使在生理?xiàng)l件下具有殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的殺傷性效應(yīng)的細(xì)胞亞群，主要是CD8＋殺傷性T淋巴細(xì)胞（CTL，約70%）和自然殺傷細(xì)胞（NK，約10%）得到大量的擴(kuò)增和活化，之后經(jīng)一次或多次回輸給患者。CIK作為細(xì)胞過繼性免疫治療方法，可有效輔助惡性腫瘤和慢性傳染性病毒感染的治療。

1. CIK治療適應(yīng)癥

（一）確診為惡性腫瘤或EBV、CMV、HPV、HBV、HCV病毒感染；

（二）預(yù)期生存期＞3個(gè)月的患者； 

（三）實(shí)驗(yàn)室檢查必須符合下列條件：淋巴細(xì)胞值＞0.8×109/L；

（四）病人有自知能力，能簽署知情或志愿同意書；

（五）患者依從性較好，能配合針對(duì)毒副反應(yīng)的治療；

（六）抗HIV（－），TPHA（－）；

2. CIK治療禁忌癥

（一）合并顱內(nèi)高壓或意識(shí)不清的顱腦腫瘤；

（二）癥狀性心衰或嚴(yán)重心律失常；

（三）彌漫性血管性內(nèi)凝血；

（四）血清肌酐和/或尿素氮≥正常值的1.5倍；

（五）敗血癥或其他難以控制的感染；

（六）腸梗阻；

（七）經(jīng)治療后心臟病情仍不穩(wěn)定，入組前1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)過心肌梗塞；

（八）有癥狀的周圍神經(jīng)病變＞2級(jí)（NCIC-CTG標(biāo)準(zhǔn)）；

（九）不可控制的糖尿??；

（十）嚴(yán)重精神紊亂；

（十一）雙磷酸鹽難以控制的高鈣血癥，血鈣濃度＞12mg/100ml；

（十二）妊娠及哺乳期婦女；

（十三）合并傳染性疾病：艾滋病、梅毒等；

（十四）T淋巴細(xì)胞相關(guān)性淋巴瘤和白血病患者；

（十五）有嚴(yán)重的T淋巴細(xì)胞相關(guān)自身免疫病的患者；

（十六）因感染引起的發(fā)熱患者；

3. CIK的治療方案

（一）單獨(dú)使用

（二）與化療聯(lián)合使用

（三）與靶向治療聯(lián)合使用

4. CIK血標(biāo)本采集護(hù)理

（一）采血前做好患者的評(píng)估，包括病情、意識(shí)狀態(tài)、生命體征、正在進(jìn)行的治療、靜脈充盈情況、患者的理解及合作能力；

（二）兩人核對(duì)患者的床號(hào)、姓名、住院號(hào)、采血時(shí)間、采血量等；

（三）告訴患者采血的目的和方法，讓患者放松情緒，避免緊張；

（四）采血時(shí)協(xié)助患者取平臥位或坐位，暴露靜脈，選擇粗、直、大靜脈，嚴(yán)格無菌操作采集血標(biāo)本；

（五）采血過程中注意觀察患者面色、神志，詢問患者有無頭暈、心慌等不適，如患者有頭暈、乏力、心悸不適等情況即停止采血，報(bào)告醫(yī)生，協(xié)助處理，采血完成按壓穿刺點(diǎn)10min；

（六）將盛裝血標(biāo)本試管輕柔180°顛倒搖勻5～8次，以達(dá)到更好的抗凝效果，然后將血標(biāo)本裝于密封袋，貼上封條，存放于血樣箱（溫度4～8℃）立即送細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)；

（七）填寫細(xì)胞培養(yǎng)血標(biāo)本采集護(hù)理記錄單。

5. CIK血樣本采集注意事項(xiàng)

（一）采血前，患者可以飲溫開水、低脂清淡飲食；

（二）采血前，不可以進(jìn)行任何輸液治療；

（三）采血前1天，患者不可以進(jìn)行可能損傷、破壞淋巴細(xì)胞的治療和檢查項(xiàng)目，如放療、化療、核醫(yī)學(xué)檢查等；

（四）連續(xù)兩個(gè)療程治療時(shí)，取血和回輸細(xì)胞在時(shí)間上會(huì)有交叉，取血必須在細(xì)胞回輸之前；

（五）3天內(nèi)的血常規(guī)，要求白細(xì)胞在正常范圍，淋巴細(xì)胞值大于0.8×109/L；

（六)采血量取決于患者淋巴細(xì)胞數(shù)，采血量ml×淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)>0.8×109/L，約為20-100ml；

（七）如需凍存細(xì)胞，采血量需要增加；

（八）血標(biāo)本采集后，置入4～8℃無菌運(yùn)轉(zhuǎn)箱由專人及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室，一般標(biāo)本放置時(shí)間不能超過4h。

6.CIK回輸護(hù)理

（一）心理護(hù)理，如客觀講解CIK的療效及可能出現(xiàn)的副作用，消除患者及家屬的疑惑和恐懼心理，取得配合。細(xì)胞治療作為一種新療法給腫瘤患者帶來希望，但其療效存在個(gè)體差異，應(yīng)讓患者和家屬充分知情，可避免患者因不能達(dá)到預(yù)期的療效而出現(xiàn)心理落差；

（二）確定回輸時(shí)間，通知患者，根據(jù)治療需要合理安排回輸工作；

（三）CIK細(xì)胞送到病房，護(hù)士應(yīng)與實(shí)驗(yàn)員核對(duì)病人姓名、住院號(hào)、CIK編號(hào)、制備日期、回輸日期、包裝是否完整、細(xì)胞質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果等；

（四）經(jīng)外周靜脈給患者回輸，嚴(yán)格無菌操作，注意調(diào)節(jié)滴速，先慢后快；同時(shí)注意密切觀察患者的一般情況，如體溫、脈搏、呼吸、血壓等，輸注細(xì)胞前后均使用生理鹽水沖管；

（五）輸注過程中，密切巡視，5～10min輕輕擠壓傳輸袋底部，使沉淀細(xì)胞重新懸浮，以免細(xì)胞沉淀聚集；

（六）副作用的觀察及護(hù)理

1）發(fā)熱，CIKzui常見副作用為發(fā)熱，常在回輸后1-2h內(nèi)發(fā)生，也有病人在回輸4h之后發(fā)生發(fā)熱反應(yīng)。發(fā)生發(fā)熱反應(yīng)首先向醫(yī)生匯報(bào)。一般情況，低、中度發(fā)熱時(shí)可不作特殊處理，囑患者多飲水；高熱時(shí)按醫(yī)囑冰敷等物理降溫或口服退熱藥物；患者寒戰(zhàn)時(shí)注意觀察病情變化，做好保暖，必要時(shí)給予吸氧；

2）變態(tài)反應(yīng)，患者出現(xiàn)皮疹、呼吸困難、心悸等反應(yīng)，臨床上極少見此類反應(yīng)，若出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)立即停止輸注，通知醫(yī)生，給予吸氧、抗過敏處理；

（七）回輸完畢，囑門診病人常規(guī)留觀30min, 如有不適及時(shí)告知護(hù)士；囑患者離院后如有病情變化，及時(shí)復(fù)診；

（八）觀察記錄病人情況，填寫細(xì)胞回輸護(hù)理記錄單。

7. CIK回輸注意事項(xiàng)

（一）輸注細(xì)胞前必須經(jīng)過兩人核對(duì)無誤，方可輸入；

（二）認(rèn)真檢查細(xì)胞質(zhì)量，查看細(xì)胞檢測(cè)報(bào)告；

（三）使用一次性輸血管，禁止使用帶精密過濾器的輸液管；使用7號(hào)或以上的頭皮針，避免小針頭產(chǎn)生的剪切力對(duì)細(xì)胞的損害；

（四）禁止在細(xì)胞內(nèi)加入其它藥物；

（五）注意輸注速度，起始速度30～40滴/min，觀察10min后如沒有特殊反應(yīng)，將滴速改為60～80滴/min，40～60分鐘內(nèi)輸完；

（六）細(xì)胞培養(yǎng)后要及時(shí)回輸，需要保存時(shí)必須放冰箱2～8℃保存不超過8h；

（七）放療、化療前后需間隔48小時(shí)以上方可進(jìn)行細(xì)胞回輸，防止放療、化療殺傷CIK細(xì)胞，影響療效。

二、DC-CIK

隨著細(xì)胞制備技術(shù)的日趨完善，DC-CIK細(xì)胞過繼免疫治療在臨床逐漸開展，相關(guān)報(bào)道可見。實(shí)驗(yàn)研究方面，Marten實(shí)驗(yàn)研究表明：DC和CIK共培養(yǎng)可以同時(shí)促進(jìn)CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞的增殖和免疫功能。張嵩等的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明：化療后應(yīng)用DC-CIK細(xì)胞可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長，甚至使腫瘤*消失；而且DC-CIK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)對(duì)集體免疫系統(tǒng)功能不產(chǎn)生危害，在當(dāng)前對(duì)腫瘤特異性抗原了解相對(duì)較少的情況下，應(yīng)用DC-CIK細(xì)胞作為腫瘤放化療和手術(shù)后的輔助治療有重要的臨床意義。

1. 在白血病中的應(yīng)用

趙春華等研究表明：與DC共培養(yǎng)可使CIK細(xì)胞獲得更高的增殖速率和更強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤活性，DC-CIK細(xì)胞可以作為一種臨床有效的抗白血病免疫治療策略。童春容等臨床研究顯示：DC-CIK細(xì)胞治療具有明顯清除微小殘留白血病細(xì)胞防止復(fù)發(fā)的作用，并且靜脈輸注安全。

2. 在腫瘤中的應(yīng)用

將CIK細(xì)胞和同源DC細(xì)胞共培養(yǎng)后即可獲得DC-CIK細(xì)胞。它既可促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟，更能促進(jìn)ClK的增殖，并加強(qiáng)其抗腫瘤活性。DC細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，能夠誘導(dǎo)持久有力的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)；CIK細(xì)胞可通過非特異性免疫殺傷作用清除腫瘤患者體內(nèi)微小殘余病灶，所以負(fù)載腫瘤抗原的DC與CIK的有機(jī)結(jié)合（即DC-CIK細(xì)胞）能產(chǎn)生特異性和非特異性的雙重抗腫瘤效應(yīng)。

三、DC治療對(duì)腫瘤治療的原理

①DC可以高表達(dá)MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子，MHC分子與其捕獲加工的腫瘤抗原結(jié)合，形成肽-MHC分子復(fù)合物，并遞呈給T細(xì)胞，從而啟動(dòng)MHC-I類限制性CTL反應(yīng)和MHC-Ⅱ類限制性的CD4+ Thl反應(yīng)。同時(shí)，DC還通過其高表達(dá)的共刺激分子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等)提供T細(xì)胞活化所必須的第二信號(hào)，啟動(dòng)了免疫應(yīng)答。

②DC與T細(xì)胞結(jié)合可大量分泌IL-12、IL-18激活T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)CTL生成，主導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，利于腫瘤清除；激活穿孔素P顆粒酶B和FasL/Fas介導(dǎo)的途徑增強(qiáng)NK細(xì)胞毒作用；

③DC分泌趨化因子(Chemotactic Cytokines， CCK)專一趨化初始型T細(xì)胞促進(jìn)T細(xì)胞聚集，增強(qiáng)了T細(xì)胞的激發(fā)。保持效應(yīng)T細(xì)胞在腫瘤部位長期存在，可能通過釋放某些抗血管生成物質(zhì)(如IL-12、IFN-γ)及前血管生成因子而影響腫瘤血管的形成。上述CCK進(jìn)一步以正反饋旁分泌的方式活化DC，上調(diào)IL-12及CD80、CD86的表達(dá)；同時(shí)DC也直接向CD8+T細(xì)胞呈遞抗原肽，在活化的CD4+ T細(xì)胞輔助下使CD8+ T細(xì)胞活化，CD4+和CD8+T細(xì)胞還可以進(jìn)一步通過分泌細(xì)胞因子或直接殺傷，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答。

四、ACTL

全稱“ AAV-DC-CTL靶向性抗腫瘤細(xì)胞免疫技術(shù)"，簡稱“ACTL™"或“ACTL技術(shù)"或“ACTL腫瘤細(xì)胞靶向治療"。

"ACTL™ Anti-Cancer Cellular Immunotherapy"

1. ACTL技術(shù)背景

2011年10月3日，加拿大科學(xué)家、美國醫(yī)學(xué)會(huì)和美國國家科學(xué)院院士拉爾夫?斯坦曼（Steinman）教授獲得2011年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。斯坦曼獲獎(jiǎng)的原因在于他在“樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cell, DC細(xì)胞）及其在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)方面作用的發(fā)現(xiàn)"。21世紀(jì)初，美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤中心劉勇教授在斯坦曼教授的指引下將其研究的以重組腺相關(guān)病毒(Recombinant Adeno-associated Virus, rAAV)與斯坦曼教授研究的DC細(xì)胞相結(jié)合，研發(fā)以攜帶某種或數(shù)種特定腫瘤相關(guān)抗原決定簇基因的重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞，在體外刺激患者T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生特異性殺傷某種或數(shù)種腫瘤相關(guān)抗原陽性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic Lymphocyte, CTL細(xì)胞），隨后進(jìn)行相關(guān)的臨床試驗(yàn)研究，獲得成功。此治療技術(shù)稱為ACTL腫瘤細(xì)胞靶向治療技術(shù)，已獲得5項(xiàng)保護(hù)，由此技術(shù)制備的特異性殺傷腫瘤相關(guān)抗原陽性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞稱為特異殺傷性T細(xì)胞（ACTL，A代表特異性抗原）具有性、靶向性（即特異性）殺傷某種或數(shù)種特定腫瘤相關(guān)抗原陽性腫瘤細(xì)胞以及PSMA 陽性的腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的強(qiáng)大功能，對(duì)正常細(xì)胞無損傷作用。

ACTL腫瘤細(xì)胞靶向治療技術(shù)臨床應(yīng)用的典型例子為斯坦曼教授自身晚期胰腺癌的治療和蘋果公司喬布斯晚期胰腺癌的治療。拉爾夫?斯坦曼（Steinman）教授僅采用了此治療技術(shù)，生存時(shí)間為4年。

在斯坦福大學(xué)腫瘤中心，經(jīng)過數(shù)年的臨床研究，于2010年證明了ACTL特異殺傷性T細(xì)胞不僅能夠直接靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，而且可封閉腫瘤新生血管，發(fā)揮間接殺傷腫瘤細(xì)胞作用，明顯提升臨床療效。此項(xiàng)研究成果被2010年美國腫瘤臨床學(xué)會(huì)(ASCO)評(píng)為2010年度上半年腫瘤生物治療領(lǐng)域zui重要的突破。

在美國進(jìn)行的臨床研究表明，ACTL特異殺傷性T細(xì)胞不僅有可能逆轉(zhuǎn)婦科和前列腺等惡性腫瘤對(duì)抗激素治療產(chǎn)生的耐藥性，而且有可能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)易瑞沙、阿瓦斯丁等分子靶向藥物治療的耐藥性。

2. ACTL技術(shù)治療機(jī)理

AAV-DC-CTL™腫瘤細(xì)胞靶向治療技術(shù)是將無致病性的野生型腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV) 通過基因重組技術(shù)改建為攜帶特定腫瘤相關(guān)抗原決定簇基因的重組腺相關(guān)病毒，感染患者的外周血單核細(xì)胞 (Monocytes. Mo)，經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)，單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)大抗原提呈功能的DC細(xì)胞。經(jīng)此技術(shù)獲得的DC細(xì)胞在體外刺激患者的T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生有效殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CytotoxicT lymphocytes, CTL)。所產(chǎn)生的CTL 具有腫瘤抗原特異性，即靶向性，僅針對(duì)某種或數(shù)種特定腫瘤相關(guān)抗原陽性的腫瘤細(xì)胞以及PSMA 陽性的腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞具有殺傷作用，對(duì)抗原陰性的細(xì)胞無任何作用。

CTL細(xì)胞是CD8+的T細(xì)胞亞群，為一種特異T細(xì)胞，對(duì)某些病毒、腫瘤細(xì)胞等具有直接殺傷作用，與自然殺傷細(xì)胞構(gòu)成機(jī)體抗病毒、抗腫瘤的重要防線。CTL殺傷機(jī)制有：

①釋放穿孔素，顆粒酶，裂解靶細(xì)胞。

②通過FasL介導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡。

推薦產(chǎn)品及相關(guān)產(chǎn)品匯總表：

一、CIK